小動物活體成像實驗步驟通常包括光學(xué)標記、構(gòu)建動物模型和活體動物成像三大部分，以下是詳細的實驗步驟：

一、光學(xué)標記

質(zhì)粒構(gòu)建與擴增純化

制備帶有熒光素酶報告基因（如luc基因）或編碼熒光蛋白基因的真核表達質(zhì)粒。

對質(zhì)粒進行擴增和純化，以獲得足夠的質(zhì)粒用于細胞轉(zhuǎn)染。

細胞轉(zhuǎn)染與篩選

選擇對數(shù)生長期的目標細胞，將細胞接種于培養(yǎng)板中，待細胞融合度達到適宜范圍（如80%~90%）后進行轉(zhuǎn)染。

將目標細胞、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑及足量的質(zhì)粒載體懸浮液共培養(yǎng)一段時間（如6小時），之后補充新鮮的培養(yǎng)液。也可采用電轉(zhuǎn)染等方式提高轉(zhuǎn)染效率。

轉(zhuǎn)染后，使用抗生素（如G418）進行篩選，直至出現(xiàn)單細胞抗性克隆。

對單一抗性克隆進行傳代培養(yǎng)，并使用熒光素酶活性檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性，保留熒光值高的細胞克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

陽性克隆鑒定

經(jīng)過多代傳代培養(yǎng)后，再次檢測熒光素酶活性，保留熒光值維持較高的克隆直至穩(wěn)定。

熒光素酶活性最高的幾個克隆即為陽性克隆，可用于后續(xù)的動物模型構(gòu)建。

二、構(gòu)建動物模型

細胞準備

將篩選出的陽性克隆細胞進行擴增培養(yǎng)，直至達到足夠的數(shù)量。

使用適當(dāng)?shù)募毎麘乙海ㄈ鏟BS）將細胞重懸至適宜的濃度。

動物選擇與麻醉

選擇適宜的實驗動物（如小鼠），并根據(jù)實驗需求選擇性別、年齡和體重等。

對實驗動物進行麻醉，以確保其在成像過程中保持靜止。

細胞接種

根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)慕臃N方式（如尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等）。

將準備好的細胞懸液接種到實驗動物的體內(nèi)，并觀察其生長和轉(zhuǎn)移情況。

三、活體動物成像

成像前準備

將實驗動物放入成像暗箱平臺中，并調(diào)整平臺的升降以獲得合適的視野。

根據(jù)成像需求選擇合適的激發(fā)和發(fā)射濾片（對于熒光成像）或注射相應(yīng)的底物（對于生物發(fā)光成像）。

成像操作

對于熒光成像，打開激發(fā)光源并拍攝熒光圖像。

對于生物發(fā)光成像，在注射底物后等待一段時間（如10分鐘），然后關(guān)閉外界光源并拍攝由實驗動物體內(nèi)發(fā)出的光。

將拍攝的背景圖與生物發(fā)光圖像疊加，以清晰地顯示實驗動物體內(nèi)光源的位置。

圖像分析

使用專業(yè)的圖像分析軟件對拍攝的圖像進行處理和分析。

選定感興趣的區(qū)域進行測量和數(shù)據(jù)處理，以獲得實驗數(shù)據(jù)。

后續(xù)處理

根據(jù)實驗需求對實驗動物進行后續(xù)處理，如取腫瘤組織進行病理形態(tài)學(xué)分析等。

以上步驟可能因?qū)嶒灄l件、實驗動物和成像技術(shù)的不同而有所差異。在實際操作中，應(yīng)根據(jù)具體情況進行調(diào)整和優(yōu)化。同時，實驗過程中應(yīng)嚴格遵守相關(guān)的實驗規(guī)范和倫理要求。